科研 WR：揭示亚硝酸盐氧化细菌在主流PN/A过程中的适应性：机制和对策
亚硝酸盐氧化菌（NOB）的稳定抑制仍然是主流处理中实施部分硝化和厌氧氨氧化（PN/A）的主要挑战。
工艺的长期稳定运行。本研究旨在了解其中的适应机制并制定克服适应的对策。为此，
三种先前已论证的抑制策略，包括通过用游离氨（FA）处理侧流污泥灭活NOB、使用低溶解氧（DO）和使用厌氧氨氧化菌清除亚硝酸盐，被依次应用于实验室规模的反应器处理来自高速活性污泥（HRAS）工厂的流出物超过800天。
菌被引入用于原位消除亚硝酸盐。组合策略提供了可靠的NOB抑制，在剩余的实验期间（八个月）中没有出现进一步的适应现象。
一阶段PN/A反应器实现84.2 ± 5.37%的脱氮效率。相同条件下平行运行但未进行FA处理的对照反应器，仅实现了10.4 ± 4.6%的脱氮效率，在最后阶段厌氧氨氧化菌被NOB淘汰。
在主流处理中的适应性，揭示不同抑制因素的适应机制，并相应地制定对策。本研究选择了三种具有前景的
）策略和亚硝酸盐清除（通过厌氧氨氧化）策略。当观察到适应时，依次更换上述策略。在每次适应之前和之后，通过实验研究
。实验在两个实验室规模的序批式反应器（SBR）上进行，反应器接纳实际主流废水（来自中试规模高速活性污泥（HRAS）工厂的出水），每个反应器运行800天（共分为I-VI阶段
）。主要涉及动力学特性分析、16S rRNA基因扩增子测序、化学分析等方法。
在第I阶段（第0-200天），实验反应器和对照反应器都进行了完全硝化，进水中的铵转化为硝酸盐（图1A，图S1A）。两个反应器的NAR均低于1%（图1B，图S1B）。NOB的原位体容积速率与AOB的容积速率重叠（图1C和图S1C），表明在两个反应器中，由AOB形成的亚硝酸盐立即被NOB转化为硝酸盐。对于实验反应器，在第200天开始用FA处理污泥，开启II阶段。第II阶段（第240-300天）的稳态下，稳定的亚硝酸盐积累建立在20.4 ± 3.6 mg N L
（图1A），NAR为92.1 ± 3.2%（图1B）。原位NOB活性为0.20 ± 0.05
（图1C），仅为阶段I的3%。出水和原位活性数据均表明NOB被成功抑制。对于对照SBR，第II阶段的NAR保持在1%以下（图S1B），并且原位NOB活性保持与AOB的相似。II阶段实验反应器的原位AOB活性与基线阶段或II期对照反应器的原位AOB活性没有显著差异（
0.05），表明基于FA的污泥处理没有危害AOB活动。此外，根据设计，通过使用基于pH值的曝气控制，出水中的铵/亚硝酸盐比率保持在大约1:1。
图1 （A）实验反应器出水中铵、亚硝酸盐和硝酸盐浓度分布。红色箭头表示采集混合液样品进行微生物分析的时间；（B）亚硝酸盐积累率（NAR）；（C）实验反应器中的AOB和NOB的原位容积活性和挥发性悬浮固体（VSS）浓度。
稳定的PN在第II阶段持续了大约两个月。从第301天开始，建立的亚硝酸盐积累开始崩溃，出水的硝酸盐逐渐积累（图1A），导致NAR下降到15.3 ± 2.6%（图1B）。反应器中的原位NOB活性反弹至5.50 ± 1.12 mg N L
（图1C）。显然，NOB在此期间适应了FA处理。因此，第301-402天记作第III阶段，在此期间进一步研究了NOB的适应机制。
最大容积亚硝酸盐氧化速率作为NOB丰度的代理指标，在整个I-III阶段受到密切监测（图2A）。亚硝酸盐氧化的最大能力从第I阶段到第II阶段由9.80 ± 2.30降低到0.3 ± 0.1 mg N L
。相应地，在第180天（第I阶段）、第280天（第II阶段）和第390天（第III阶段）进行的16S rRNA 基因测序揭示了NOB群落的明显转变（图2B）。在基线天），NOB群落最初以
为主,其相对丰度为3.66 ± 0.05%。当通过FA抑制的污泥处理实现了体系中稳定的亚硝酸盐积累时，
的相对丰度在第II阶段（第280天）降低至0.10 ± 0.02%，表明该策略成功抑制了
Nitrotoga出现，相对丰度为2.13 ± 0.06%。这些新出现的
Nitrotoga的出现表明它们可以应对日常性基于FA的污泥处理的压力。在对照污泥中，整个I-III阶段的最大亚硝酸盐氧化速率稳定保持在10.20 ± 2.60
始终主导着NOB群落（图S2）。此外，在实验反应器和对照反应器中，最大氨氧化速率与AOB群落相对恒定，在整个I-III阶段变化很小（表S2）。
Nitrotoga如何应对基于FA的污泥处理，对第III阶段的实验污泥（含
）分别使用培养实验进行调查。此外，还通过比较FA处理前后的活性NOB浓度（
Nitrotoga主导适应FA处理）仅发生了2 log的灭活。不同的存活率表明
Nitrotoga的增殖。此外，AOB生长和失活动力学的比较显示出类似的趋势。与未适应的污泥相比，适应FA的污泥具有更高的
）和较低的AOB灭活效率（1 log相较于1.5 log）（图S3），表明AOB也适应了FA处理。然而，AOB的灭活效率基本比NOB的灭活效率低1-2个数量级（图S3）。
图2 （A）阶段I (n = 20)、II (n = 11)、III (n = 9)的最大容积亚硝酸盐氧化速率；（B）实验反应器中第I阶段（第180天）、第II阶段（第280天）、第III阶段（第380天）的亚硝酸盐氧化细菌（NOB）群落。
对照反应器和实验反应器的污泥培养批实验在第Ⅲ阶段（第301-402天）进行。
- 1/SRT）低于0的水平来克服。在第III阶段，实验污泥中AOB的表观氧亲和力估值高于NOB（
）（图4）。因此，低DO可能会在第III阶段消除适应FA的NOB，同时保留AOB。
在第403天，实验反应器中的DO从1.5-2.0减少到0.2-0.4 mg O
，开启阶段IV。在DO减少后不久，NAR重建于95.4 ± 3.8%，并且检测到可忽略不计的原位NOB活性（图1B和1C），表明低DO有效抑制了已适应FA抑制策略的NOB。使用较低的DO也将原位AOB活性从6.20 ± 1.50 mg N L
，导致出水中铵浓度升高。因此，在阶段IV中流出的铵/亚硝酸盐比上升到2.2 ± 0.5，高于厌氧氨氧化工艺所需的化学计量比（图1A）。与此同时，对照反应器仍按照I-III阶段运行，表现出与早期阶段相似的性能（图S1）。
图4 （A）AOB对氧的表观亲和力；（B）阶段III（未适应低DO）和阶段V（适应低DO）的实验污泥中的NOB。
低DO只是暂时抑制了实验反应器中的NOB。低DO处理大约3个月后，NOB适应了V阶段（第502-525天）的低DO，出现硝酸盐浓度上升、NAR急剧下降和原位NOB活性的反弹（图1）。出水中铵的减少和原位AOB活性的上升表明AOB也适应了低溶解氧。
实验污泥中NOB的表观氧亲和力从阶段III（应用低DO之前）的1.01 ± 0.17 mg O
时，NOB原位容积活性仅达到阶段III的43%，这最终导致NOB 在第IV阶段被淘汰。随着
第V阶段中的原位NOB容积活性恢复到III阶段水平的77%（假设其他动力学参数不变），从而导致NOB在V阶段回归。此外，AOB还获得了更高的氧亲和力，
Nitrotoga在阶段IV或阶段V中不再被检测到。常在低DO系统中被报道占主导地位的
。事实上，尽管性能和原位活性数据显示出显著的亚硝酸盐氧化活性（图1），但在V阶段并未检测到已知的NOB。阶段V中负责亚硝酸盐氧化的执行者可能是一些新物种，它们不仅具有高氧亲和力，而且具有很强的FA抗性。
为了响应NOB对FA处理和低DO的适应，载体生物膜上的厌氧氨氧化菌被添加到两个反应器中作为亚硝酸盐清除者，进料和曝气模式如2.2中所述。在过渡期（第550-620天）出现初始波动后，实验反应器和对照反应器的出水氮逐渐稳定（图 5A，图S6A）。在实验反应器中，六个月（第621-800天）以来出水中的硝酸盐为4.1 ± 1.3
（图5A），检测到的原位亚硝酸盐氧化率仅为0.2 ± 0.1 mg N L
（图5B）。这些结果表明，基于FA的污泥处理、低DO和厌氧氨氧化清除亚硝酸盐的组合策略可以稳定地抑制实验反应器中的NOB活性。相比之下，NOB继续在相同条件下运行的对照反应器中茁壮生长，该反应器没有执行基于FA的污泥处理鼎博下载注册，其原位亚硝酸盐氧化率为3.9 ± 0.2 mg N L
的硝酸盐作为主要的氮物质，铵和亚硝酸盐的含量可以忽略不计（图S6A）。
16S rRNA基因测序揭示了第VI阶段的稳态下（第780天）悬浮物和生物膜中NOB的相对丰度（表1）。对于实验反应器，悬浮物中几乎检测不到NOB，但生物膜中有所保留（
占0.4 ± 0.1%）。需要注意的是，仅絮状污泥进行了定期FA处理，而载体未进行。对于对照反应器，NOB（
属）同时存在于絮体和生物膜中，相对丰度分别为2.6 ± 0.5%和1.1 ± 0.4%。
作为辅助视角，本研究还评估了与悬浮物和生物膜相关的最大NOB活性（表 1）。根据微生物分析结果，实验反应器絮状物中的NOB活性显著低于比对照反应器（
0.001），证明了FA处理在抑制NOB絮状污泥方面的有效性。相比之下，生物膜相关的NOB显示出显著的亚硝酸盐氧化能力（4.97 ± 0.32 mg N L
0.05）对照反应器中的生物膜（3.60 ± 0.93 mg N L
）。这与实验反应器生物膜中NOB的显著存在非常吻合。有趣的是，实验反应器中的NOB仅显示0.2 ± 0.1 mg N L
的低原位亚硝酸盐氧化率（图 5B）。原位亚硝酸盐氧化率和最大亚硝酸盐氧化率之间的巨大差距可能与原位低DO（0.2-0.4 mg L
）水平有关。之前的研究发现，NOB倾向于将自身嵌入生物膜的内层，而AOB则在外层生长。生物膜分层将进一步限制NOB获得氧气和亚硝酸盐。由于生物膜中的NOB具有理论上无限长的保留时间，因此即使原位生长速度低也可以支持它们在系统中（在生物膜中）的保留。
同期还测量了AOB和厌氧氨氧化的相对丰度和最大活性。絮状物和生物膜AOB的相对丰度在实验反应器和对照反应器之间相当（表1）。实验和对照污泥也一致地反映了絮状物和生物膜相关的最大AOB活性。然而，两个反应器表现出了不同的厌氧氨氧化曲线。对于实验反应器，微生物和最大活性数据共同表明厌氧氨氧化菌仅存在于生物膜中。絮状物中不存在厌氧氨氧化菌的原因可能是絮状污泥的SRT较短（~15天），以及絮状物经常暴露于354 ± 58 mg NH
的FA可以显著抑制厌氧氨氧化活性。对于对照反应器，在絮体和生物膜中均未检测到厌氧氨氧化细菌及其活性，表明NOB对厌氧氨氧化的筛选。
三种策略的协同作用实现了长期（六个月）稳定的NOB抑制。基于FA的污泥处理和低DO方法虽然由于适应性问题无法长期完全抑制NOB，但与AOB相比，NOB的活性有所减弱，影响降低（图5B）。这种差异导致了在阶段VI曝气终止时亚硝酸盐的积累（图S8A）。积累的亚硝酸盐在随后的非曝气阶段被厌氧氨氧化菌清除，因此亚硝酸盐在下一个曝气循环中不能被NOB利用（图S8A）。通过这种方式，NOB能源的损失导致循环中NOB的增长减少，从而在随后的曝气阶段积累更多的亚硝酸盐。这种上升螺旋循环的持续，最终导致NOB被淘汰。作为比较，在对照反应器中，由于没有实施FA处理，每个曝气期间亚硝酸盐都被NOB完全耗尽（图S8B），在接下来的非曝气期间没有亚硝酸盐用于厌氧氨氧化。逐渐地，厌氧氨氧化菌在系统中被NOB淘汰。
表1 第Ⅵ阶段（第620-800天）稳态下实验组和对照组反应器中NOB、AOB和厌氧氨氧化的生物量组成和最大容积速率。
5 （A）出水氮浓度；（B）第Ⅵ阶段（526-800天）引入厌氧氨氧化载体后实验反应器中AOB和NOB的原位容积速率和挥发性悬浮物（VSS）浓度。
在阶段VI的稳态期间，实验反应器出水TIN为6.6 ± 3.1 mg N L
，实现了84.2 ± 5.4%的平均脱氮效率（表2）。相比之下，在没有厌氧氨氧化载体的整个I-V 阶段，TIN去除效率分别仅为9.6 ± 2.1%、12.8 ± 3.2%、10.0 ± 2.4%、11.6 ± 3.3%和11.9 ± 2.8%。阶段 I-V中有限的氮去除表明HRAS出水中存在的COD不能有效支持反硝化。对照反应器的氮去除性能进一步支持了这一点，六个阶段的平均TIN去除效率为11.2 ± 2.8%。出现这些结果的原因可能在于原废水中易于生物降解的COD大部分在上游的HRAS工厂已被捕获。实验反应器和VI阶段对照反应器的脱氮性能比较（84.2 ± 5.4%对10.4 ± 4.6%，表2）表明，单独的厌氧氨氧化反应贡献了大约70%的TIN去除效率。结果清楚地表明，组合策略成功在实验反应器中建立了稳定的一阶段PN/A过程。
由于PN/A在污水处理厂实现能源中和的巨大潜力，在主流处理中实施 PN/A工艺一直是过去十年的热点领域。迄今为止，已经取得了具有潜在价值的成果。主流PN/A最初是在单一生物膜（载体上或颗粒中）形态中得到论证。生物膜滞留时间长，可有效滞留生长缓慢的厌氧氨氧化菌。此外，生物膜中固有的扩散阻力可以通过氧气限制促进NOB抑制。通常，单一生物膜PN/A系统中的DO需要控制在0.2 mg L
以下。对DO控制的严格要求不仅给全规模的推广带来了操作困难，而且会危及AOB活性，从而限制了整体速率。为了克服AOB速率的限制，将絮状污泥引入生物膜系统，构成混合生物质形态。絮凝体的松散结构比相比于生物膜减少了扩散阻力，因此能够实现更高的速率。然而，松散结构下的低扩散阻力会导致絮体中NOB的生长，这会严重降低PN/A工艺的稳定性和出水水质。絮状污泥相关的NOB可以由通过配合激进的絮状污泥SRT（ 7天）和低溶解氧（ 0.2 mg L
）来控制。这些恶劣的条件同时也会严重影响与絮状污泥相关的AOB活动，即与引入絮状物的最初目标相矛盾。
这项研究提供了一个替代维度来控制IFAS系统中与絮状物泥相关的NOB。相比于现有的IFAS系统，含有污泥/消化液接触池（其中混合了浓缩的絮状污泥与AD出水中富含FA的上清液）的IFAS系统如图6所示。通过在絮状污泥上引入基于FA的处理作为附加抑制因子，IFAS系统中的主流PN/A可以稳定地保持在比文献报道的相对更高的DO水平（
）和更长的SRT（15天）。由于DO探头检测范围内的精度或安装的曝气器和鼓风机的尺寸等因素存在，在实验室规模向全规模的推广过程中，实现控制DO低于0.2 mg O
具有一定难度。这可以部分解释尽管实验室规模研究取得了广泛的成功而主流PN/A试点或全规模示范罕见之原因。基于FA的絮凝污泥处理为混合主流PN/A系统增加了更多的操作灵活性，使主流PN/A更接近其实际应用。
该研究同时证实了主流PN/A工艺中亚硝酸盐清除的必要性。通过逐步应用三种有前景的NOB抑制策略，即基于FA污泥处理策略、限氧（低DO）策略和清除亚硝酸盐（通过厌氧氨氧化菌）策略，本研究发现前两种策略可以被NOB适应，而亚硝酸盐清除则不能被轻易适应。结论与大多数成功的主流PN/A示例一致：在报道示例的一阶段PN/A系统中，厌氧氨氧化菌确实可以作为亚硝酸盐清除者。
本研究之所以按照FA处理、氧气限制和亚硝酸盐清除的顺序部署组合策略，原因在于最初计划是论证两阶段PN/A的可行性。然而，如长期运行结果所示，没有原位亚硝酸盐清除者的两阶段配置对于主流PN/A工艺来说并不是一个容易可行的方案。此外，事后看来，如果首先通过添加厌氧氨氧化菌来清除亚硝酸盐，而没有对絮状污泥进行FA污泥处理，那么在长期运行中，絮状物相关的NOB将淘汰厌氧氨氧化菌（如对照反应器所示）（图S6）。
前人的研究提出了FA和FNA的交替处理以克服NOB适应的策略。交替处理策略在以合成废水为原料的实验室规模反应器中稳定抑制了
Nitrotoga，不能简单地通过FA或FNA污泥处理来抑制。的确，本研究的第III阶段观察到
Nitrotoga导致了FA污泥处理的失效。因此，引起其他维度的控制策略，例如限氧和亚硝酸盐清除，对于在处理实际污水中实现稳定的NOB抑制也是必要的。
）作为为厌氧氨氧化提供亚硝酸盐的替代方案。与硝化反硝化相比，PD结合厌氧氨氧化（PD/A）工艺可节省50%的曝气和80%的有机物需求。尽管节省量低于PN/A（60%的曝气和100%的有机物需求），但PD/A的长期稳定性似乎更容易保持，这已在实验室规模甚至全规模工厂中得到证明。因此，PD可以替代PN，或与PN结合，为主流厌氧氨氧化提供稳定的亚硝酸盐，这需要在未来的研究中进一步深入探索。
本研究旨在阐明NOB适应各种抑制策略的机制，并制定相应地对策。为此，两个反应器接收实际的缺碳废水连续运行了800天。在此期间，基于FA的污泥处理、0.2-0.4 mg O
的低溶解氧处理以及厌氧氨氧化去除亚硝酸盐策略逐步实施，在反应器内进行了依次实施。得出以下结论：
• NOB能够通过种群调整适应基于FA的污泥处理和低DO，与最初存在的NOB相比，新兴种群对FA处理表现出更高的抵抗力、更高的生长速度和更高的氧亲和力。
基于FA的污泥处理、低DO和厌氧氨氧化清除亚硝酸盐相结合，是稳定抑制NOB的有效途径。
•本研究证实了亚硝酸盐清除在稳定抑制NOB中不可或缺的作用。结果进一步表明，由于在部分硝化阶段不存在亚硝酸盐清除者
0755-2651 0822
